液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量
石杉堿甲是石杉科植物中提取的一種生物堿，是一強效的膽堿酯酶可逆性抑制劑，其作用特點與新斯的明相似，但作用維持時間比后者為長。對真性膽堿酯酶具有選擇性的抑制，抑制強度是假性膽堿酯酶的數千倍；抑制方式為競爭性和非競爭性的混合型抑制，與單純競爭性抑制劑有顯著不同；易通過血腦屏障進入中樞，兼具有中樞及外周治療作用；有效時間長；從胃腸道吸收良好；安全指數大；穩定性好。
由于蕨類植物生長緩慢，繁殖困難，造成了石杉堿甲的原料藥價格昂貴，因此，建立一個石杉堿甲含量的快速檢測方法很有必要。為了科學、合理地利用石杉屬植物資源，采用HPLC法對石杉中石杉堿甲的含量進行測定，為尋找和篩選石杉堿甲新的植物資源提供科學依據。
1、儀器與試藥
安捷倫液相色譜儀HPLC((帶四元泵，自動進樣器，紫外檢測器等);梅特勒天平;KQ50B超聲清洗器;電熱恒溫水浴鍋;石杉堿甲對照品(100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。
實驗藥材采至貴州黔東南，由貴州科學院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉，標本存放于貴陽中醫學院民族醫藥研究所，標本憑證(20056)。
昆明石杉
2、液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量方法與結果
2.1色譜條件
ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈 (92∶8)，檢測波長為310nm，流速1ml·min-1，柱溫25℃，進樣量為5μl。在此色譜條件下，樣品中的石杉堿甲與其他峰能達到基線分離， 其理論塔板數為4656，對稱因子為0.92。石杉堿甲的保留時間為11.15min。
2.2樣品的制備
精密稱取實驗藥材細粉2g于500ml的圓底燒瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次，合并濾液并 回收溶劑，加入2%的酒石酸溶解，用氨水調節pH值至8.0，再用氯方萃取至Dragendorffors反應呈陰性，揮干有機溶劑，用無水乙醇溶解并定 容至25ml即得。
2.3線性關系的考察
精密稱取石杉堿甲對照品2.40mg于25ml容量瓶中以無水乙醇溶解并定容，得濃度為0.096mg·ml-1對照品溶液，再分別稀釋成 0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的對照品供試液，在色譜條件下測定。以進樣濃度對峰面積進行回 歸，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995。可知石杉堿甲在0.015～0.48μg之間與峰面積呈良好線性關系。
2.4精密度實驗
取石杉堿甲對照溶液，在色譜條件下重復進樣6次，結果石杉堿甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。
2.5穩定性實驗
取供試品溶液，每隔2h測定1次，考察石杉堿甲的含量變化，結果含量的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品在10h內穩定。
2.6重復性實驗
精密稱樣品6份，按“2.2”項的要求制備6份供試液，在色譜條件下分別進行測定，結果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。
2.7回收率實驗
精密稱取昆明石杉藥材細粉6份，每份1g，分別加入對照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml，按樣品制備方法和色 譜條件，制備加樣回收供試液進行測定，計算回收率(見表1)。結果石杉堿甲的平均回收率為99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉堿甲加樣 回收率實驗結果(略)
2.8樣品的測定
按“2.2”項的要求精密稱取樣品3份，制備供試液，按色譜條件進行測定，重復3次，取平均值，石杉堿甲在原植物中的平均含量為0.03%。
3、液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲含量的結論
我們建立了用HPLC反相柱從石杉總堿中直接測定石杉堿甲的方法，該方法線性與精密度良好，平均回收率為99.89%，平均RSD為0.40%。實驗證明該方法易行、靈敏、準確、可靠。在生產石杉堿甲的工作中得到了證實。
測定方法是在其它石杉中石杉堿甲含量測定方法的基礎上，改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動相。
從石杉堿甲原植物中提取總生物堿，是一個常規和穩定的方法。通過測定總堿中石杉堿甲的含量，便可以推算出原植物中石杉堿甲的含量。該方法已經成為檢定原植物的方法并應用于工作中。
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