HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中關(guān)鍵部件為輸液泵、 色譜柱、檢測器。有些液相色譜儀器儀器還配備有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預(yù)柱或保護柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司(例如 安捷倫液相色譜儀Agilent 1200分析速度可以比標準液相 快20倍，同時分離度提高60%。它的分析速度比同類廠家的快速液相快1至2倍。 1200高分離度快速液相還可以運行標準液相色分析方法，是市場上zui靈活的液 相色譜系統(tǒng)。若配備高通量進樣系統(tǒng)，1200高分離度快速液相色譜甚至每天可 以分析多達2000個樣品。如圖1 )、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
*：輸掖泵的選擇
輸液泵是HPLC系統(tǒng)中zui重要的部件之一，目前應(yīng)用zui多的是柱塞往復(fù)泵，柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫，其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好(RSD為 0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%)，但出故障的機會較多(因多一單向閥)，價格也較貴。泵的性能好壞將直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可*性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其 RSD應(yīng)<0.5%，這對定性定量的準確性至關(guān)重要;②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達到100 ml/min;③輸出壓力高，一般應(yīng)能達到150~300 kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好，耐腐蝕。
第二：進樣器的選擇
進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得* 的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達到1~2%;加之能耐各 種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子) 和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進樣量準確，重 復(fù)性好(0.5%)，操作方便。
4.自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。
第三：色譜柱的選擇
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用 于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為 3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難分離物質(zhì)對 則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使zui 好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，*近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是 管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。
1.柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi) 壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑 0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm)， 柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn)，內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm;③毛細管柱(又稱微柱 microcolumn)，內(nèi)徑0.2~0.5mm;④半制備柱，內(nèi)徑>5mm;⑤實驗室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm;⑥生產(chǎn) 制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
2.柱的發(fā)展方向
因強調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細管柱和內(nèi)徑 小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優(yōu)點是：①節(jié)省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱 溫;⑥易于實現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè) 備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進樣閥能準確、重復(fù)地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電 化學檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。
3.柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度>20μm時，干法填充制備柱較為合適;顆 粒<20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters;③軸 向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣 品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性 在±5%或±10%以內(nèi)。進行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
第四：檢測器的選擇
檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴?/span>HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低(即對溫度、流量等外界變化不敏感)、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。
1.性能指標
1)噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度 和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速(泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會影響測 定的準確度，應(yīng)盡量減小。
2)靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電 信號的大小，單位為mV·ml/g。對質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
2)檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。
檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(通常用2倍或3倍噪音表示)時進入檢測器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢 測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml;對質(zhì)量型檢測器指的是單位時間內(nèi)進入檢測器的量，單位g/s或mg/s)。又稱為敏感度(detectability)。D=2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。
3)線性范圍(linear range)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進樣量(濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度)之比。也可用響 應(yīng)信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準確與否，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號與樣品量呈線性關(guān)系，這樣進行定量測定 時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A=BCx，B為響應(yīng)因子，當x=1時，為線性響應(yīng)。對大多數(shù)檢測器來說，x只在 一定范圍內(nèi)才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
4)池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl。在使用細管徑柱時，池體積應(yīng)減少到1~2μl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。
第五：數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)
計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數(shù) 據(jù);②控制儀器;③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。
第六：恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對分離選擇性影響不大;還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對分離有影響;但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(zhì)(如緩沖劑)加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內(nèi)。
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